摘 要:本研究拟研发一种可用于基层的快速选药试剂盒。通过增菌液的筛选、固体培养基的筛选、药物的筛选和快速选药效果
的比对,初步组建了一种海水养殖细菌性疾病快捷选药试剂盒,经局部区域的中试和试验后发明,该试剂盒成果幻想,操作简便,
适用于基层作为防治海水细菌性疾病的选药工作。
要害词:细菌性疾病;试剂盒;快速选药;海水
中图分类号:S941. 42 文献标识码:A
Research and Development on Rapid Choose
M edicine K it forM ariculturalBacteriosis
QIU Jun-qiang1,LIUWei2, FU Qiao-fang1,YANG Xiao-le1,WANG Jian-ping3*
(1. ShanghaiOceanUniversity, NationalPathogen Collection Center forAquaticAnimals, Shanghai201306,China; 2. Faculty ofLife Sci-
ence and Biotechnology ofNingBoUniversity, ZhejiangNingbo 315211,China; 3. NingboAcademy ofOcean and Fishery, ZhejiangNingbo
315010,China)
Abstract
his study aimed to develop a kit of rapidly choosingmedicine for the grass roots. By screening enriched bacteria, solid medium
andmedicine, comparing effects of rapidly choosingmedicine, a kit that could pick up the rightmedicine quickly formariculture bacteriosis
was created.The pilot test in some regions showed the kitwas suitable for grass-rootsworking.
Key words:Bacteriosis; Kit; Screeningmedicine; Seawater
养殖密渡过大、环境恶化和其它多种起因导致
近年来海水养殖细菌性疾病频发,造成宏大的经济
丧失。因为养殖者迷信常识的缺少和市场经济好处
的驱使,滥用渔药特殊是抗生素的景象广泛存在,导
致水产致病菌的耐药性、水产品药残、环境传染及生
态破坏等问题日益加剧。要从源头上解决抗生素滥
用问题,症结是在医治前进行药敏试验,从而在准确
诊断的基本上隔靴搔痒。
国际上常用的药敏试验方法是K-B纸片法。
采用这种方法进行药敏试验请求将致病菌分离纯
化,须要花1周左右的时间,而且必需在专业的微生
物实验室条件下,由具备专业知识的人员完成,因此
不合适在宽大养殖者中推广。为懂得决这个问题,
笔者研发了一种快速准确的药敏试验方法以及与之
配套的选药安装,适用于海水养殖细菌性疾病的快
速选药。
1 资料与方法
1・1 实验菌株
鳗弧菌(Vibrio anguillarum)由国度水活泼物病
原库(上海大陆大学)保留。均分离自患细菌性疾
病的海水鱼,各菌株LD50均低于107cfu/mL。
1・2 培养基
1. 2. 1 液体培养基 分别采用3种海水细菌增菌
液配制,分别命名为L1、L2和L3。
1. 2. 2 固体培养基 分别采用3种海水细菌固体
培养基配方,分别命名为S1、S2和S3。
3 实验药物
盐酸多西环素、甲砜霉素、氟苯尼考、诺氟沙星、
乳酸诺氟沙星、恩诺沙星、盐酸恩诺沙星、乳酸恩诺
沙星、盐酸沙拉沙星、硫酸新霉素、磺胺间甲氧嘧啶
钠、复方磺胺二甲嘧啶、复方磺胺甲�唑、复方磺胺
嘧啶、阿莫西林和青霉素G共16种药物,均为原
粉,为各兽用原料药生产厂家赠予样品,含量均在
98%以上。
1・4 液体培养基增菌效果
将实验菌种经活化后调至浓度为107cfu/mL数
量级后,分别接种于L1、L2和L3培养基中。接种
量1%,培养温度25℃,培养箱转速200 r/min,培
养时间均为18 h。分光光度计法测细菌增菌前后浓
度。每组3个平行。
倍增率=每组增菌培养后菌液浓度/每组增菌
培养前菌液浓度。
1・5 固体培养基培养效果
将液体培养基增菌培养后的菌液103cfu/mL数
量级后取100μ,l分辨涂布于S1, S2和S3固体造就
基颠倒的平板上, 25℃培养18 h。计数克隆构成数
量情形。
克隆造成率=克隆实际形成个数/涂布前菌体
实践个数×100%。
1・6 试剂盒的组装
此部分另由专利申请部门表述,暂略。
1・7 试剂盒药物敏感性实验的比对
采用K-B法,用以上16种药物分别对病原菌
进行药物敏感性实验。
采用本试剂盒解释书的方法,用以上16种药物
分离对3种病原菌进行药物敏感性实验。
2 结果与剖析
2・1 液体增菌效果
从表1可以看出:培养基L2最适于菌株成长,
本研讨即选定该液体培养基作为增菌液。
表1 3种不同液体培养基对菌株生长的影响
Table 1 Different effects of three liquid mediums on the bacterial
strain growth
培养基
名称
增菌培养前菌液
平均浓度(107cfu/mL)
增菌培养后菌液
均匀浓度(1010cfu/mL)倍增率
L1 2. 0 1. 14 570
L2 2. 0 8. 4 4200
L3 2. 1 2. 3 1095
2・2 固体培养基培养后果
经t测验后三者差别不显著(P>0. 1),本研究
即选定培养基S1作为固体培养基。
2・3 试剂盒组装及组成
试剂盒由1个塑料培养盒(内含固体培养基
S1), 1个贮药圈, 1支试管(内含液体培养基L2), 1
份仿单组成。
2・4 试剂盒药敏结果的比对
从表3能够看出,采取2种方式进行药敏试验,
本试剂盒与K-B法进行对比,仅乳酸诺氟沙星和盐
酸沙拉沙星两个结果略有不同,其它结果均相同。
阐明本试剂盒基础可以到达惯例K-B法进行药敏
实验的准确性。
2・5 试剂盒操作方法
2. 5. 1 筹备 将手、剪刀和解剖容器(如盘子等)
荡涤清洁。剪刀消毒可用75%医用酒精、水煮或火
烧等情势消毒。
2.5. 2 取样 选病症典型的濒逝世动物个体,净水洗
净解剖部位;用剪刀解剖动物,察看病变,再次消毒
剪刀后,剪取约黄豆大小的典范病灶(如肝脏发生
典型病变,则优先取肝脏)直接放入试管,盖紧试管
盖。
2.5. 3 液体培养 使劲振荡试管数次后,放置至液
体浑浊(温度越低,放置时间应越长。参考时间为:
30~37℃,本文来源于:
美女图片 http://www.chz.cn, 8~13 h; 25~30℃, 13~18 h),应避免
阳光直射。
2.5. 4 固体培养 将试管内液体倒入培养盒的中
心部位(应防止倒入管底积淀物),微微晃动盒体使
液体流过固体培养基的每个角落,并平均散布,静置
2 min后将过剩液体倒回试管。敞盖平放晾干,至
表面基本干燥。掏出贮药圈,将药敏纸片朝下嵌入
培养盒中,压实,使纸片与培养基名义充足接触。拧
紧盒盖倒置至出现透明区(约需8~15 h)。
2.5. 5 结果断定 出现透明区的抗生素均可作为
备选药物,透明区较大的抗生素可作为优选药物。
表2 3种不同固体培养基对菌株生长的影响
Table 2 Different effects of three solid mediums on the bacterial
strain growth
培养基
名称
涂布前菌
体理论个数
克隆实际
形成个数
克隆形成率
(% )
S1 120 115 95. 8
S2 110 103 93. 6
S3 120 112 93. 3
7592期 邱军强等:一种海水养殖中细菌性疾病倏地选药试剂盒的研发
表3 K-B法和本试剂盒法对16种药物对菌株的敏感性结果比对
Table 3 Comparison ofKB method and this kit on strain sensitivity to 16 drugs
药物名称K-B法本试剂盒药物名称K-B法本试剂盒
甲砜霉素M M盐酸沙拉沙星M S
氟苯尼考S S硫酸新霉素S S
盐酸多西环素S S磺胺间甲氧嘧啶钠R R
利福平S S复方磺胺二甲嘧啶R R
盐酸恩诺沙星M M复方磺胺甲�唑R R
恩诺沙星M M复方磺胺嘧啶R R
诺氟沙星R R阿莫西林S S
乳酸诺氟沙星R M青霉素G S S
注: S-敏感;R-抗性;M-中度敏感。
Note: S-sensitive;R-resistant;M-medium sensitivity.
综合斟酌本类病害的常用药品种、用药史、药价、给
药方法、进出口划定等因素,选出最适合的抗生素。
如果固体培养时,未长出细菌或细菌呈雀斑状分布,
则表明病害可能不是由细菌感染引起,假如固体培
养时,细菌已充满全部培养盒,但未呈现透明区,则
表明贮药圈上的药物在标准使用剂量时对致病菌无
效,倡议使用其余方法从新进行选药。
3 讨 论
细菌性病害由病原菌感染、传布引起,有些病原
菌的抗生素敏理性变更很快,仅凭教训用药往往没
有效果。同时,若因为药物选用失误不仅易导致抗
药性的发生和内源性沾染的发生,而且对水产品德
量跟环境都是极大的损坏。因而,病害产生时最好
进行多种抗生素的药敏检测,从中选出无公害的有
效药物用于治疗。通过有的放矢,在最短时间内控
制病害、减少经济损失;同时,无公害用药还能保证
养殖产品顺利出口或作为绿色食物内销。
药敏检测的原理在于:药敏纸片与固体培养基
接触后,纸片所含的抗生素在固体培育基中扩散,如
该抗生素可能克制细菌生长,则纸片周围会产生无
菌透明区;如果该抗生素不能抑制细菌生长,则纸片
四周不会涌现透明区。
国际上常用的药敏试验方法是K-B纸片法。
采用这种方法进行药敏试验要求将致病菌分离纯
化,需要花一周左右的时间,而且必须在专业的微生
物实验室前提下由具备专业知识的职员实现,因此
不适合在广大养殖者中推广。为了解决这个问题,
研发了这种快速准确的药敏试验方法以及与之配套
的选药装置,适用于海水养殖细菌性疾病的快速选
药。
本试剂盒是一种便利适用的药敏检测盒,能帮
助用户快速准确地从多种常用药当选出有效的治疗
药物。重要实用于海水养殖细菌性病害的快速诊断
选药,如腹水病、烂鳃病、烂尾病、烂头病、肠炎病、溃
疡病、白皮病等。
从与常规的K-B纸片法进行比对的结果看,本
试剂盒根本可以达到常规K-B法进行药敏实验的
正确性,可在实际出产中运用。
上述快速选药方法省去了尺度选药流程中致病
菌分离、纯化、鉴定等多少个限速步骤。把选药时间从
本来的1~2周大幅度缩短到1~2 d,为在病害发生
初期节制病情争夺了可贵的时间;同时,它还解脱了
致病菌分别、纯化、鉴定过程中对庞杂操作和专业仪
器装备的依附,使其可以在一些陈规模的养殖场和
基层渔业技巧部分遍及。这都会极大地增进药敏试
验在水产养殖范畴的推广和应用。
虽然快速选药方法省去了一些限速步骤,而且
不严厉进行无菌操作,但这些都不会对选药结果
产生实质的影响。这是由于在组织样品中致病菌占
据着相对上风的位置,而微生物存在在某一环境中
保持其种群优势的特征。因此,在短时光的雷同培
养条件下,其它杂菌根本无奈转变优势致病菌的主
导地位,这就从基本上保障了尔后的药敏试验是针
对优势致病菌进行的,那么药敏试验所显示的各种
抗生素的抑菌效果也是针对该致病菌的。到目前为
止,近百次的实际应用结果也表明,这种快速选药方
法与标准的病害诊断选药方法比拟,精确率达到90
%以上,而且用药的效果十分明显,多在3~5 d即
可把持或解除病情,进而从实际的角度验证了快速
选药办法的可行性。
固然本试剂盒已初具雏形,但还需在应用进程
中对其进前进一步的优化和改良以适应不同的需要
和开发出不同的试剂盒。
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